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蔡司扫描电镜植物叶片样品处理方法

来访:
时间: 2023-01-11 10:31:13

 它是叶类植物的主要营养器官之一,对植物叶片的观察对植物种类的鉴定起着非常重要的作用。植物的叶表皮特征具有一定的遗传稳定性,叶表皮的微形态特征也能在一定程度上反映类群间的亲缘关系。

目前,应用蔡司扫描电镜观察植物的精细结构特征已成为植物学研究的重要手段之一,但这些植物样品中普遍含有水分。对于含水量较低的植物样品,通常只需通过表面清洁、样品贴在样品台上等简单过程即可进行观察。但是,如果直接观察含水量高的植物样品,在蔡司扫描电镜的真空管中会造成很多不良后果:
①样品经电子束轰击后,蒸发的水蒸气遇到高能电子流,发生电离放电,产生较大波动,使图像模糊,起雾,或根本不成像;
 
②大部分样品在高真空下容易发生形态损伤,使研究特征收缩变形;
 
③物镜、镜头、光圈污染;④灯丝遇水蒸气氧化、变质,甚至熔断。
 
虽然近年来出现了可以观察含水样品的蔡司扫描电子显微镜,但上述观察方法的分辨率较低。因此,目前无水样品的扫描电镜被广泛应用。因此,要获得良好的蔡司扫描电镜观察效果,制样方法是关键,一般需要固定、脱水、更换、干燥。本文对扫描电镜制样过程中植物叶片的固定、脱水、置换和干燥的不同研究方法进行了总结和比较,以期为相关研究提供参考。
固定的;不变的目前有戊二醛、FAA、锇酸、卡诺固定剂、甲醇等。广泛用于固定植物叶片。对于一些容易固定或不易变形的材料,为了降低实验成本,可以使用戊二醛进行固定。固定溶液浓度的选择很大程度上取决于叶子样品的含水量和嫩度。用过低或过高浓度的戊二醛溶液(4℃固定4 h)处理嫩叶和含水量高的叶片时,大部分叶片失水严重,导致表面形态观察不清。选择合适的浓度进行固定处理,观察效果比较好,叶细胞形态比较饱满。
脱水
对于植物叶片样品的脱水置换处理,常用的方法是在每个浓度下用梯度乙醇溶液脱水15 min,然后用叔丁醇置换100%乙醇。室温下,先用乙醇-叔丁醇溶液20 min,再用100%叔丁醇30min,再用100%叔丁醇反复置换一次。置换过程中省略了乙醇-叔丁醇溶液的处理,直接用100%叔丁醇置换三次即可获得理想的结果。此外,在脱水前,研究人员可以使用所选固定剂对应的缓冲溶液进行反复清洗,以去除固定剂,防止戊二醛与锇酸反应或防止戊二醛与脱水剂(乙醇、叔丁醇)反应,导致沉淀,影响固定化效果。
干燥的
样品的干燥方法有多种,如自然干燥、烘箱干燥、临界点干燥、叔丁醇真空干燥和冷冻干燥。自然干燥法一般可用于含水量低、细胞壁厚、蜡质层厚的植物叶片或老叶,操作简便。干燥法适用于坚硬耐热的植物叶片,如被子植物叶片。临界点干燥法和叔丁醇真空干燥法几乎适用于各种植物样品,但考虑到操作的复杂性,当可以采用更简单的干燥方法时,一般不选用。冷冻干燥法能反映样品真实的微形态特征,但冷冻干燥过程中冷冻和脱水胁迫会对植物叶片造成损伤。需要掌握最佳的冻干温度和时间,适合水分较多的幼叶。
 
本文将水稻、小麦、花生的叶片用4%戊二醛溶液固定2小时,再用30~100%梯度乙醇脱水(每个浓度15分钟),再用100%叔丁醇反复置换3次(每次30分钟),最后自然风干。叶子晒干后,样品喷金,然后在扫描电镜下观察。
图3显示了蔡司台式扫描电子显微镜下的叶片形态。图(a)和(b)显示了水稻叶的表面形态,图(c)和(d)显示了小麦叶的表面形态,图(e)和(f)显示了花生叶的表面形态。在蔡司扫描电镜下,处理后的叶片可获得良好的微形态结构,细胞形态良好,边界清晰,气孔形态正常,但仍有轻微收缩现象。目前无论用什么方法对扫描电镜样品进行预处理,都不能完全避免细胞皱缩、膨胀等变形,也没有一种扫描电镜处理和观察方法可以适用于所有类型的植物叶片,只能达到一种相对理想的状态。为了取得更好的效果,大家需要在未来不断探索。
 
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